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熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)步驟

更新時(shí)間：2019-08-30瀏覽：4779次

　　推薦關(guān)鍵詞：熒光定量PCR耗材，實(shí)驗(yàn)室耗材

，PCR管，PCR板

，本生生物PCR耗材

　　熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)步驟：

　　①取凍存已裂解的細(xì)胞

，室溫放置5分鐘使其*溶解

。

　　②兩相分離每1ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2ml的lvfang

，蓋緊管蓋

。手動(dòng)劇烈振蕩管體15秒后，15到30℃孵育2到3分鐘

。4℃下12000rpm離心15分鐘

。離心后混合液體將分為下層的紅色酚lvfang相，中間層以及無(wú)色水相上層

。RNA全部被分配于水相中

。水相上層的體積大約是勻漿時(shí)加入的TRIZOL試劑的60%。

　?div id="d48novz" class="flower left">

、跼NA沉淀將水相上層轉(zhuǎn)移到一干凈無(wú)RNA酶的離心管中

。加等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA，混勻后15到30℃孵育10分鐘后

，于4℃下12000rpm 離心10分鐘

。此時(shí)離心前不可見(jiàn)的RNA沉淀將在管底部和側(cè)壁上形成膠狀沉淀塊。

　?div id="jpandex" class="focus-wrap mb20 cf">、躌NA清洗移去上清液

，每1mlTRIZOL試劑裂解的樣品中加入至少1ml的75%乙醇(75%乙醇用DEPCH2O配制)，清洗RNA沉淀

?div id="jfovm50" class="index-wrap">；靹蚝螅?℃下7000rpm離心5分鐘

。

　?div id="jfovm50" class="index-wrap">、軷NA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘

。

　?div id="jfovm50" class="index-wrap">、奕芙釸NA沉淀溶解RNA時(shí)，先加入無(wú)RNA酶的水40μl用槍反復(fù)吹打幾次

，使其*溶解

，獲得的RNA溶液保存于-80℃待用。 1)紫外吸收法測(cè)定

　　先用稀釋用的TE溶液將分光光度計(jì)調(diào)零

。然后取少量RNA溶液用TE稀釋(1:100)后

，讀取其在分光光度計(jì)260nm和280nm處的吸收值，測(cè)定RNA溶液濃度和純度

。

　?div id="jfovm50" class="index-wrap">、?濃度測(cè)定

　　A260下讀值為1表示40 μg RNA/ml。樣品RNA濃度(μg/ml)計(jì)算公式為：A260 ×稀釋倍數(shù)× 40 μg/ml

。具體計(jì)算如下：

　　RNA溶于40 μl DEPC水中

，取5ul，1:100稀釋至495μl的TE中

，測(cè)得A260 = 0.21

　　RNA 濃度= 0.21 ×100 ×40 μg/ml = 840 μg/ml 或 0.84 μg/μl

　　取5ul用來(lái)測(cè)量以后

，剩余樣品RNA為35 μl，剩余RNA總量為：

　　35 μl × 0.84 μg/μl = 29.4 μg

　?div id="jfovm50" class="index-wrap">、诩兌葯z測(cè)

　　RNA溶液的A260/A280的比值即為RNA純度

，比值范圍1.8到2.1。

　　2)變性瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定

　?div id="d48novz" class="flower left">

、僦颇z

　　1g瓊脂糖溶于72ml水中

，冷卻至60℃，10 ml的10× MOPS電泳緩沖液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)

。

　　灌制凝膠板

，預(yù)留加樣孔至少可以加入25 μl溶液。膠凝后取下梳子

，將凝膠板放入電泳槽內(nèi)

，加足量的1×MOPS電泳緩沖液至覆蓋膠面幾個(gè)毫米。

　?div id="jpandex" class="focus-wrap mb20 cf">、跍?zhǔn)備RNA樣品

　　取3μgRNA

，加3倍體積的甲醛上樣染液，加EB于甲醛上樣染液中至終濃度為10μg/ml

。加熱至70℃孵育15分鐘使樣品變性

。

　?div id="jpandex" class="focus-wrap mb20 cf">、垭娪?/p>

　　上樣前凝膠須預(yù)電泳5min，隨后將樣品加入上樣孔

。5–6V/cm電壓下2h

，電泳至溴酚蘭指示劑進(jìn)膠至少2–3cm。

　?div id="jpandex" class="focus-wrap mb20 cf">、茏贤馔干涔庀掠^察并拍照

　　28S和18S核糖體RNA的帶非常亮而濃(其大小決定于用于抽提RNA的物種類型)

，上面一條帶的密度大約是下面一條帶的2倍。還有可能觀察到一個(gè)更小稍微擴(kuò)散的帶

，它由低分子量的RNA(tRNA和5S核糖體RNA)組成

。在18S和28S核糖體帶之間可以看到一片彌散的EB染色物質(zhì)，可能是由mRNA和其它異型RNA組成

。RNA制備過(guò)程中如果出現(xiàn)DNA污染

，將會(huì)在28S核糖體RNA帶的上面出現(xiàn)，即更高分子量的彌散遷移物質(zhì)或者帶

，RNA的降解表現(xiàn)為核糖體RNA帶的彌散

。用數(shù)碼照相機(jī)拍下電泳結(jié)果。 ①反應(yīng)體系序號(hào) 反應(yīng)物劑量 1 逆轉(zhuǎn)錄buffer 2μl 2 上游引物 0.2μl 3 下游引物 0.2μl 4 dNTP 0.1μl 5 逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV 0.5μl 6 DEPC水 5μl 7 RNA模版 2μl 8 總體積 10μl 輕彈管底將溶液混合

，6000rpm短暫離心

。

　　②混合液在加入逆轉(zhuǎn)錄酶MMLV 之前先70℃干浴3分鐘

，取出后立即冰水浴至管內(nèi)外溫度一致

，然后加逆轉(zhuǎn)錄酶0.5μl，37℃水浴60分鐘

。

　?div id="m50uktp" class="box-center"> 、廴〕龊罅⒓?5℃干浴3分鐘，得到逆轉(zhuǎn)錄終溶液即為cDNA溶液

，保存于-80℃待用

。管家基因(β-actin)實(shí)時(shí)定量PCR

　　①β-actin陽(yáng)性模板的標(biāo)準(zhǔn)梯度制備陽(yáng)性模板的濃度為1011

，反應(yīng)前取3μl按10倍稀釋(加水27μl并充分混勻)為1010

，依次稀釋至109、108

、107

、106、105

、104

，以備用。

　　②反應(yīng)體系如下：

　　標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)體系序號(hào) 反應(yīng)物劑量 1 SYBR Green 1 染料 10μl 2 陽(yáng)性模板上游引物F 0.5μl 3 陽(yáng)性模板下游引物R 0.5μl 4 dNTP 0.5μl 5 Taq酶 1μl 6 陽(yáng)性模板DNA 5μl 7 ddH2O 32.5μl 8 總體積 50μl 輕彈管底將溶液混合

，6000rpm短暫離心

。

　　管家基因反應(yīng)體系：序號(hào) 反應(yīng)物劑量 1 SYBR Green 1 染料 10μl 2 內(nèi)參照上游引物F 0.5μl 3 內(nèi)參照下游引物R 0.5μl 4 dNTP 0.5μl 5 Taq酶 1μl 6 待測(cè)樣品cDNA 5μl 7 ddH2O 32.5μl 8 總體積 50μl 輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心

。

　?div id="jpandex" class="focus-wrap mb20 cf">、壑苽浜玫年?yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品和檢測(cè)樣本同時(shí)上機(jī)，反應(yīng)條件為：93℃2分鐘

，然后93℃ 1分鐘，55℃ 2分鐘

，共40個(gè)循環(huán)

。 ①針對(duì)每一需要測(cè)量的基因，選擇一確定表達(dá)該基因的cDNA模板進(jìn)行PCR反應(yīng)

。

　　反應(yīng)體系：序號(hào) 反應(yīng)物劑量 1 10×PCR緩沖液 2.5 ul 2 MgCl2溶液 1.5 ul 3 上游引物F 0.5 ul 4 下游引物R 0.5 ul 5 dNTP混合液 3 ul 6 Taq聚合酶 1 ul 7 cDNA 1 ul 8 加水至總體積為 25ul 輕彈管底將溶液混合

，6000rpm短暫離心。

　　35個(gè)PCR循環(huán)(94℃1分鐘;55℃1分鐘;72℃1分鐘); 72℃延伸5分鐘

。

　?div id="jpandex" class="focus-wrap mb20 cf">、赑CR產(chǎn)物與 DNA Ladder在2%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色

，檢測(cè)PCR產(chǎn)物是否為單一特異性擴(kuò)增條帶

。

　　③將PCR產(chǎn)物進(jìn)行10倍梯度稀釋: 設(shè)定PCR產(chǎn)物濃度為1×1010

，依次稀釋至109

、108、107

、106

、105、104幾個(gè)濃度梯度

。 ①所有cDNA樣品分別配置實(shí)時(shí)定量 PCR反應(yīng)體系

。

　　體系配置如下：序號(hào) 反應(yīng)物劑量 1 SYBR Green 1 染料 10 ul 2 上游引物 1ul 3 下游引物 1ul 4 dNTP 1ul 5 Taq聚合酶 2ul 6 待測(cè)樣品cDNA 5ul 7 ddH2O 30ul 8 總體積 50 ul 輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心

。

　?div id="4qifd00" class="flower right">

、趯⑴渲坪玫腜CR反應(yīng)溶液置于Realtime PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)條件為：93℃2分鐘預(yù)變性

，然后按93℃ 1分鐘

，55℃1分鐘，72℃1分鐘

，共40做個(gè)循環(huán)

，后72℃7分鐘延伸。各樣品的目的基因和管家基因分別進(jìn)行Realtime PCR反應(yīng)

。PCR產(chǎn)物與 DNA Ladder在2%瓊脂糖凝膠電泳

，GoldView染色

，檢測(cè)PCR產(chǎn)物是否為單一特異性擴(kuò)增條帶。

　　終歸屬權(quán)：本生(天津)健康科技有限公司

，以上資料僅供參考!