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實(shí)驗(yàn)方法原理:
實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)
，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法。儀器
、耗材:離心管
離心機(jī)
風(fēng)光光度計(jì)
電泳槽
凝膠板
Realtime PCR儀
實(shí)驗(yàn)步驟:
一
、 樣品RNA的抽提1. 取凍存已裂解的細(xì)胞，室溫放置5分鐘使其*溶解
。二
、 RNA質(zhì)量檢測(cè)1. 紫外吸收法測(cè)定
先用稀釋用的TE溶液將分光光度計(jì)調(diào)零。然后取少量RNA溶液用TE稀釋(1:100)后
，讀取其在分光光度計(jì)260nm和280nm處的吸收值，測(cè)定RNA溶液 濃度和純度。(1)濃度測(cè)定
A260下讀值為1表示40 ug RNA/ml
。樣品RNA濃度(μg/ml)計(jì)算公式為：A260 x 稀釋倍數(shù) x 40 ug/ml。具體計(jì)算如下：RNA溶于40 ul DEPC水中，取5 ul
，1:100稀釋至495 ul的TE中，測(cè)得A260 = 0.21RNA 濃度= 0.21 x 100 x 40 ug/ml = 840 ug/ml 或 0.84 ug/ul
取5 ul用來(lái)測(cè)量以后，剩余樣品RNA為35 ul
，剩余RNA總量為：35 ul x 0.84 ug/ul = 29.4 ug
(2)純度檢測(cè)
RNA溶液的A260/A280的比值即為RNA純度
，比值范圍1.8到2.1。2. 變性瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定
(1)制膠
三
、樣品cDNA合成四
、 梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品及待測(cè)樣品的管家基因(β-actin)實(shí)時(shí)定量PCR五、 制備用于繪制梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的DNA模板
六
、 待測(cè)樣品的待測(cè)基因?qū)崟r(shí)定量PCR1. 所有cDNA樣品分別配置實(shí)時(shí)定量 PCR反應(yīng)體系
。2. 體系配置如下：
序號(hào) 反應(yīng)物 劑量
1 SYBR Green 1 染料 10 ul
2 上游引物 1 ul
3 下游引物 1 ul
4 dNTP 1 ul
5 Taq聚合酶 2 ul
6 待測(cè)樣品cDNA 5 ul
7 ddH2O 30 ul
8 總體積 50 ul
輕彈管底將溶液混合，6 000 rpm短暫離心
。(3)將配制好的PCR反應(yīng)溶液置于Realtime PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)
。反應(yīng)條件為：93℃ 2分鐘預(yù)變性，然后按93℃ 1分鐘，55℃1分鐘，72℃1分鐘，共40做個(gè)循環(huán)七、 實(shí)時(shí)定量PCR使用引物列表
引物設(shè)計(jì)軟件：Primer Premier 5.0
八、電泳
各樣品的目的基因和管家基因分別進(jìn)行Realtime PCR反應(yīng)
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