,溫育足夠時間后,洗滌除去未結(jié)合的成分
,再加入酶標工作液,溫育足夠時間后
,洗滌除去未結(jié)合的成分
。依次加入底物A、B
,底物(TMB)在辣根過氧化物酶(HRP)催化下轉(zhuǎn)化為藍色產(chǎn)物
,在酸的作用下變成黃色,顏色的深淺與樣品中抗BB抗體(BB-Ab)濃度呈正相關(guān)
,450nm波長下測定OD值
,根據(jù)標準品和樣品的OD值,計算樣本中抗BB抗體(BB-Ab)含量
。
【試劑盒組成】
1酶標包被板12孔×8條7底物夜A6mL
2標準品:200ng/ml0.6mL8底物夜B6mL
320倍濃縮洗滌液20mL9終止液6mL
4標準品稀釋液6mL10說明書1份
5樣本稀釋液6mL11封板膜1張
6酶標試劑6mL12密封袋1個
備注:標準品用標準品稀釋液依次稀釋為:200
、100、50
、25
、12.5、6.25ng/ml
【人抗BB抗體(BB-Ab)ELISA試劑盒需要而未提供的試劑和器材】
1
、37℃恒溫箱
標準規(guī)格酶標儀
精密移液器及一次性吸頭
蒸餾水
一次性試管
吸水紙
【操作步驟】
1
、準備:從冰箱取出試劑盒,室溫復溫平衡30分鐘
。
2
、配液:用蒸餾水將20倍濃縮洗滌液稀釋成原倍的洗滌液。
3
、加標準品和待測樣本:取足夠數(shù)量的酶標包被板
,固定于框架上,分別設置標準品孔
、待測樣本孔和空白對照孔
,記錄各孔位置,在標準品孔中加入標準品50μL;待測樣本孔中先加入待測樣本10μL
,再加樣本稀釋液40μL(即樣本稀釋5倍);空白對照孔不加
。
4
、溫育:37℃水浴鍋或恒溫箱溫育30min。
5
、洗板:棄去液體
,吸水紙上拍干,每孔加滿洗滌液
,靜置1min
,甩去洗滌液,吸水紙上拍干
,如此重復洗板4次(也可用洗板機按說明書操作洗板)
。
6、加酶標工作液:每孔加入酶標工作液50μL
,空白對照孔不加
。
7、溫育:重復4的操作
。
8
、洗板:重復5的操作。
9
、顯色:每孔先加入顯色劑A 液50μL
,再加入顯色劑B液 50μL,37℃避光顯色15min
。
10
、終止:取出酶標板,每孔加終止液50μL
,終止反應(顏色由藍色立轉(zhuǎn)黃色)
。
11、測定:以空白孔調(diào)零
,在終止后15分鐘內(nèi)
,用450nm波長測量各孔的吸光值(OD值)。
12
、計算:根據(jù)標準品的濃度及對應的OD值
,計算出標準曲線的直線回歸方程,再根據(jù)樣本的OD值
,在回歸方程上計算出對應的樣品濃度
,也可以使用各種應用軟件來計算。終濃度為實際測定濃度乘以稀釋倍數(shù)
。
人抗BB抗體(BB-Ab)ELISA試劑盒使用說明書
【樣本要求】
1
、樣本不能含疊氮鈉(NaN3),因為疊氮鈉(NaN3)是辣根過氧化物酶(HRP)的抑制劑
。
2
、標本采集后盡早進行提取
,提取按相關(guān)文獻進行,提取后應盡快進行實驗
。若不能立即試驗
,可將標本放于-20℃保存,但應避免反復凍融
。
3
、樣本應充分離心,不得有溶血及顆粒
。
【人抗BB抗體(BB-Ab)ELISA試劑盒注意事項】
1
、實驗嚴格按照說明書的操作進行,實驗結(jié)果判定必須以酶標儀讀數(shù)為準
。
2
、酶標包被板開封后如未用完,應立即裝入密封袋中加干燥劑保存
。
3
、建議所有的標準品
、樣本和空白對照都做雙份檢測
,取平均值,以減小實驗誤差
。
4
、牢記樣本已經(jīng)稀釋5倍,計算結(jié)果乘以5才是樣本實際濃度
。
5
、本試劑盒定量范圍為0.1-200ng/ml,超過此范圍
,為標準曲線延伸計算所得
,不做為準確定量結(jié)果,請用特殊稀釋液稀釋后測定準確結(jié)果(0.1-200ng/ml范圍內(nèi))
,乘以總稀釋倍數(shù)即為樣本終濃度
。
6、若顯色過淺
,可適當延長底物溫育時間
。
7、為避免交叉污染
,標準品
、樣本和空白對照每加一個就要更換一次吸頭;酶標工作液、樣本稀釋液和底物等公共組分
,要懸臂加樣
,不得碰到微孔;不得重復使用封板膜
。
8、試劑盒保質(zhì)期內(nèi)使用
,不同批號的試劑不得混用
。
9、底物B對光敏感
,避免長時間暴露于光下
。
【操作程序總結(jié)】
準備試劑,樣品和標準品 加入準備好的樣品和標準品
,37℃反應30分鐘
洗板4次
,加入酶標試劑,37℃反應30分鐘
洗板4次
,加入顯色液A
、B,37℃顯色15分鐘
加入終止液
15分鐘之內(nèi)讀OD值
計算
【檢測范圍】
0.1-200ng/ml
【規(guī)格】
96T/盒
、48T/盒
【貯藏】
2-8℃
,避光防潮保存。
【有效期】
6個月
【供應商】
天津本生