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多色免疫熒光染色試劑盒使用說明
酪酰胺信號放大(TSA，Tyramide signal amplification)技術(shù)是一類利用辣根過氧化酶(HRP)對靶蛋白進行標記的酶學(xué)檢測方法
TSA詳細原理是利用酪胺Tyramide的過氧化物酶反應(yīng)(酪胺鹽在HRP催化H202下形成共價鍵結(jié)合位點)
，產(chǎn)生大量的酶促產(chǎn)物，該產(chǎn)物能與周圍的蛋白殘基(包括色氨酸、組氨酸和酪氨酸殘基)結(jié)合，這樣在抗原-抗體結(jié)合部位就有大量的熒光素沉積，結(jié)果使其檢測信號得到10-100倍增強。簡單來說，用這種方法做多重免疫熒光是利用二抗上帶有的HRP(而不是直接偶聯(lián)熒光素)，來催化后續(xù)添加入體系的非活性熒光素。熒光素在HRP和過氧化氫的作用下被活化，跟臨近蛋白的酪氨酸殘基共價偶聯(lián)試劑盒組成：
產(chǎn)品名稱規(guī)格保 存?zhèn)渥?/p>
TYR-520熒光染料(綠光)(即用型)5mL-20℃TYR-520熒光染料
、TYR-570熒光染料 、TYR-690熒光染料 在-20度下 ，均為固體，使用之前需解凍。TYR-570熒光染料(紅光)(即用型)5mL-20℃
TYR-690熒光染料(即用型)5mL-20℃
TSA+增強劑100ul-20℃(可選)
高敏多聚hrp山羊抗兔二抗5mL4℃
TSA+增強劑使用方法：TSA+增強劑能夠進一步增強熒光信號放大液的放大信號5-10倍
，TSA+增強劑：TYR熒光放大液=1:500，使用TSA+增強劑不是必須的選項，可以根據(jù)具體的情況選擇添加或者不選擇添加。操作流程：
1、 石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入二甲benⅠ15min-二甲benⅡ15min-無水乙醇Ⅰ5min-無水乙醇Ⅱ
。取出放在通風廚內(nèi)，酒精晾干后放入自來水中稍洗，蒸餾水洗。2
、 抗原修復(fù)：組織切片置于盛滿PH 9.0 EDTA堿性抗原修復(fù)液或者PH6.0檸檬酸修復(fù)緩沖液的修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)進行抗原修復(fù)(也可以用高壓1-2min 100度水煮15min 95度水浴20min等其他熱修復(fù)方法)。中火8min3
、 阻斷內(nèi)源性過氧化物酶：切片放入3%過氧化氫溶液，室溫避光孵育15 min，將玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。4
、 BSA封閉:切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫圈(防止抗體流走)，在圈內(nèi)滴加用3%BSA-PBS(或者其他封閉液)均勻覆蓋組織，室溫封閉30min。5
、 加一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加用抗體稀釋液稀釋好的的一抗X，切片平放于避光濕盒內(nèi)4°C孵育過夜或者37度1-2h。(濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā))6
、 加hrp二抗：玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬的hrp二抗覆蓋組織，避光室溫孵育50min，PBS洗三次。7
、 熒光染料反應(yīng)：TYRXXX熒光染料反應(yīng)10-15min，PBS洗三次。8
、 重復(fù)2-7步驟(換用另外一種TYRXXX熒光染料)9、 DAPI復(fù)染細胞核：玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次
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染料激發(fā)波長發(fā)射波長
DAPI 藍色350420
TYR-480450480
TYR-520綠色490520
TYR-570紅色550570
TYR-620590620
TYR-690630690
TYR-780750780
文章引用試劑盒/方法：Co-staining of A, B and C was performed using a Four-color Fluorescence kit (Guduo Biological Technology, Shanghai, China) based on the tyramide signal amplification (TSA) technology according to the manufacture’s instruction.
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