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ELISA實驗要點：實驗結(jié)果不理想不容忽視的幾點
優(yōu)化ELISA的重點之一在于洗滌。洗滌步驟可降低未結(jié)合抗體所引起的背景信號
，從而增加分析的信噪比。每一步之間的洗滌確保只有特異的結(jié)合事件被保留，在最后一步產(chǎn)生信號在做ELISA實驗時
手工洗板
手工洗板人為因素比較大，實驗人員必須經(jīng)驗豐富
手工操作有 浸泡式 和 流水沖洗式 兩種方法：
浸泡式
1. 吸干或甩干孔內(nèi)反應(yīng)液;
2. 用洗滌液過洗一遍(將洗滌液注滿板孔后
3. 浸泡，即將洗滌液注滿板孔
4. 吸干孔內(nèi)液體
。吸干應(yīng)，可用水泵或真空泵抽吸，也可甩去液體后在清潔毛巾或吸水紙上拍干;5. 重復(fù)操作步驟3和4
，洗滌3～4次(或按說明規(guī)定)。在間接法中如本底較高，可增加洗滌次數(shù)或延長浸泡時間。微量滴定板多采用浸泡式洗滌法
。洗滌液多為含非離子型洗滌劑的中性緩沖液。聚苯乙xi載體與蛋白質(zhì)的結(jié)合是疏水性的，非離子型洗滌劑既含疏水基團，也含親水基團，其疏水基團與蛋白質(zhì)的疏水基團借疏水鍵結(jié)合，從而削弱蛋白質(zhì)與固相載體的結(jié)合，并借助于親水基團和水分子的結(jié)合作用，使蛋白質(zhì)回復(fù)到水溶液狀態(tài)，從而脫離固相載體。洗滌液中的非離子型洗滌劑一般是吐溫20，其濃度可在0.05%～0.2%之間
，高于0.2%時，可使包被在固相上的抗原或抗體解吸附而減低試驗的靈敏度。流水沖洗式
流水沖洗法最初用于小珠載體的洗滌
，洗滌液僅為蒸餾水甚至可用自來水已有實驗表明
，流水沖洗式同樣也適用于微量滴定板的洗滌。洗滌時設(shè)法加大水流量或加大水壓，讓水流沖擊板孔表面，洗滌效果更佳。洗板機洗板
洗板機洗板人為因素少，速度快
，條件恒定，但是使用洗板機洗板時應(yīng)注意以下三個關(guān)鍵點。洗滌參數(shù)
主要的參數(shù)是洗滌量
。自動洗板機會分配洗滌液。如果你之前遭遇過高背景，那么不要猶豫，將洗滌量調(diào)為高，最好是比包被體積更高。太少的洗滌液會讓一部分分析表面洗滌不到，從而明顯增加背景。所有反應(yīng)孔的洗滌量必須相同。天津本生ELISA試劑盒的使用手冊中有列出洗滌量
。我們建議使用350µl洗滌液進行洗滌，以便清潔整個反應(yīng)孔的壁。一般來說，洗滌量越高，則孵育步驟殘留的抗體或抗原量就越少。洗滌次數(shù)
影響洗滌效果的主要參數(shù)是洗滌循環(huán)的量
。當然，洗滌次數(shù)越多，背景越低。然而，太多次的洗滌會降低信號強度，使其難以測定。通常的做法是在每次抗體或抗原孵育后重復(fù)洗滌三次。不過，一般而言，包被平板需要的洗滌次數(shù)比用戶包被的平板要少。對于用戶包被的ELISA板，必須優(yōu)化洗滌次數(shù)控制洗滌量和洗滌次數(shù)的另一種方法是加入過量的洗滌液
抽 吸
還有一些參數(shù)會影響洗滌步驟的效果
。這些參數(shù)包括吸液高度和吸入位置，這兩者都能調(diào)整，以降低背景(殘留量)和差異。殘留液體中包含未結(jié)合的抗原或抗體
，它們會增加背景信號。殘留量越小，殘留液體越少，轉(zhuǎn)移到下一步的干擾液體也就越少。吸液高度會明顯影響殘留量;如果洗滌吸頭與反應(yīng)孔底部的距離稍大
，那就會讓殘留量急劇增加。反之，如果洗滌吸頭壓著反應(yīng)孔底部，那么也會使吸液效率降低，殘留量增加。目前的洗板機一般使用兩種類型的洗頭：剛性和浮動。浮動洗頭中的吸頭可在洗滌過程中自由上下移動
，而剛性洗頭則固定在適當?shù)奈恢?div id="d48novz" class="flower left">抽吸的位置也對殘留量有著重要影響;如果每個孔只使用一個抽吸點(這很常見
反應(yīng)孔的形狀也會影響殘留量
洗板時應(yīng)注意
1. 需每天校正注液量及殘液量，洗滌后殘液量不得大于2 μl
2. 及時更換破損吸液針
3. 針對不同廠家酶標板注意調(diào)整吸液頭下降高度
4. 注意調(diào)整洗液量，洗液量過多將溢出
5. 關(guān)機前使用蒸餾水沖洗管道，避免洗液的結(jié)晶物堵塞管道
4. 不同種試劑盒的洗液嚴禁混合使用
ELISA試劑盒 本生一直視質(zhì)量控制為企業(yè)的生命，追求企業(yè)競爭力的不斷提升
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