、再生纖維素和Hydrosart
,可根據不同要求靈活選用
。
使用注意事項:
(1)選擇合適的超濾管。通常應截留分子量不應大于目的蛋白分子量的1/3,比如目的蛋白分子量為35kDa,就可以選擇10kDa截留分子量的超濾管
。若目的蛋白分子量為10kD左右,則可以用截留分子量3kD的超濾管
。認真閱讀使用說明書
,注意超濾膜對各種化學物質的耐受程度有所不同。
(2)新買來的超濾是干燥的
,使用前加入超純水
,水量過膜,冰浴或冰箱里預冷幾分鐘
。然后將水倒出
,即可加入蛋白液,加入的多少
,以不超過管頂的白線為準。操作要輕
,加入蛋白液前
,超濾管需要插在冰上預冷。
(3)平衡
。質量和重心二者都要達到平衡
。注意轉速和加速度不可太快,否則直接損壞超濾膜
。開始離心超濾(離心機預冷至4度)
。不同離心機的轉速 rpm換算成g之后,有所不同
。離心機的加速度調至檔
,減小對膜的壓力。注意
,一定要等離心機達到目的轉速之后
,方可離開離心機,否則離心機出問題時
,無法第一時間處理
。膜與轉軸的方向根據說明書調整(角轉離心機的情況是膜與軸垂直)。在實際使用中
,一般轉速開的比說明書里的要低
,這樣可以延長離心管的使用壽命。
(4)當濃縮到剩下1ml時
,取50ul
緩沖溶液,加入10ul流穿
,看有沒變藍色,以此判斷超濾管是否漏掉蛋白
。如果管漏了
,將上層和流穿重新倒入新管中開始超濾。要精確判斷是否漏管
,用5mgml的BSA離心10min
,再取流穿,跑蛋白膠或Bradford粗測
,繼續(xù)加入剩下的蛋白液濃縮(在冰上操作
,防止蛋白受熱),直到所有濃縮液都加完為止
。離心過程中注意是否發(fā)生蛋白沉淀
,導致堵管。若發(fā)生沉淀
,要確定沉淀的具體原因
,是蛋白濃度過高還是Buffer不合適;前者可用多根超濾管同時超濾,降低濃度的辦法解決
,后者的方法是換不同的緩沖溶液
,直到蛋白不發(fā)生沉淀為止。
(5)前面幾步用以濃縮蛋白
,如果要換Buffer
,在總蛋白液濃縮至1ml左右的時候,輕輕加入新的Buffer(經0.22um超濾膜超濾)
,再 濃縮至1ml左右
,連續(xù)三次,最后一次的濃縮終體積根據需要的蛋白濃度而定
,一般不多于500ul
,也有濃縮至200ul以內的情況。按照每次至少10倍左右的體積濃縮算
,三次達到1000倍以上
,基本上可以達到換buffer的目的。
超濾離心管 本生一直視質量控制為企業(yè)的生命
,追求企業(yè)競爭力的不斷提升
。公司在經營中始終秉承:遵紀守法,嚴于律己
,寬仁以待
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