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ELISA實驗操作要點：ELISA檢測需做好那幾步
更新時間：2023-05-24瀏覽：1096次

　　ELISA實驗操作要點：ELISA檢測需做好那幾步


　　ELISA檢測系統(tǒng)可謂是免疫學反應應用到科研生產(chǎn)中最為廣泛最為靈敏的技術(shù)手段

?div id="m50uktp" class="box-center"> ？墒窃谛吕鲜植僮鬟^程中總是會出現(xiàn)或大或小的問題
，比如說花板
，假陽性，全顯色
，全部顯色，顯色比空白還低.
。

　　1

、包被原的性質(zhì)很重要，蛋白濃度
，是否降解
，這關系到你做出的抗體可不可以被其識別，所以保存抗原很重要
，我做重組蛋白時
，師兄都嚴格警告我一定要在冰浴下緩慢融化就是這個道理。還有有的包被原可能不是蛋白
，對于生物素和脂類物質(zhì)或小分子物質(zhì)我們要事先對其改造再加以包被
，方法簡要的列出如下:

　　①親和素生物素:先親和素先包被載體

，加入生物素化的DNA
，這種包被方法均勻、牢固
，已擴大應用于各種抗原物質(zhì)的定量測定
。

　　②脂類物質(zhì):可將其在有機溶劑(例如乙醇)中溶解后加入ELISA板孔中

，開蓋置冰箱過夜或冷風吹干
，待酒精揮發(fā)后，讓脂質(zhì)自然干固在固相表面
。

　?div id="m50uktp" class="box-center"> 、坌》肿颖仨氁揽亢痛蟮牡鞍纵d體偶聯(lián)后才能固定在固相載體上。


試劑盒1.jpg


　　2

、包被液的選擇
，一般選擇ph9.6的碳酸鹽緩沖液。但有時由于試驗的需要
，包被原的特殊性也可能采用中性的緩沖溶液來包
。應注意以下原理：由于蛋白質(zhì)與聚苯乙/烯固相載體是通過物理吸附結(jié)合的
，靠的是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)上的疏水基團與固相載體表面的疏水基團間的作用，這種物理吸附是非特異性的
，受蛋白質(zhì)的分子量
、等電點、濃度等的影響
，大分子蛋白質(zhì)較小分子蛋白質(zhì)通常含有更多的疏水基團
，故更易吸附到固相載體表面。具體的試驗還要有堅固的理論外也要實踐
，看一下最終可不可以應用到自己試驗當中去
。常用的包被液除了剛才提到的pH9.6碳酸鹽緩沖液，還有pH7.2的磷酸鹽緩沖液和pH7-8的Tris-HCL緩沖液等等
。

　　3

、封閉：繼包被之后用高濃度的無關蛋白質(zhì)溶液再包被的過程。封閉就是讓大量不相關的蛋白質(zhì)充填這些空隙
，從而排斥ELISA后的步驟中干擾物質(zhì)的再吸附
。常用封閉劑有：0.05%-0.5%的BSA;10%的小牛血清或1%明膠;脫脂奶粉，比較價廉
，可以高濃度使用(5%-10%);還有一些稀有用到的各種動物血清(主要為了排除相似蛋白干擾)和酪蛋白等等
。但最終選用什么，要依據(jù)試驗具體來實踐
。

　　4

、洗滌板：可以說在ELISA操作中，洗滌是最主要的關鍵技術(shù)
。因為聚苯乙/烯等塑料對蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的
，為達到分離游離的和結(jié)合的酶標記物的目的，清除殘留在板孔中游離的物質(zhì)
，以及非特異性地吸附的干擾物質(zhì)
，在洗滌時又應把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來。所以在洗板時會有一定誤差
，人為因素很大(當然有條件的用洗板機除外)
，洗的不或串了孔，對如此靈敏的ELISA系統(tǒng)可是不小的影響
。

　　5

、加抗體標本(和二抗):注意該換槍頭時換槍頭。標本稀釋一般可用PBS稀釋
，也可用封閉液去稀釋
。如需加二抗，還要注意二抗的工作濃度
，太高浪費
，太低則著色淺
。

　　6、顯色：顯色系統(tǒng)又很多

，我們一開始做的時候
，要選擇適宜的顯色系統(tǒng)。注意顯色系統(tǒng)酶活性底物的保存HRP結(jié)合物加硫柳泵
，AP結(jié)合物可加疊氮鈉
。

　　7、每次做盡量要把陰陽空三個對照做好

，如出現(xiàn)問題也好分析
。

　　ELISA本生一直視質(zhì)量控制為企業(yè)的生命，追求企業(yè)競爭力的不斷提升

。公司在經(jīng)營中始終秉承：遵紀守法
，嚴于律己，寬仁以待
，敢于承擔的企業(yè)精神作為標準，以過硬的質(zhì)量和優(yōu)良的服務來維護和拓展市場
，較大限度的滿足客戶的需求
。與客戶的共贏，是我們的發(fā)展目標
。本生!您信任的合作伙伴
。我們愿與您真誠合作，共創(chuàng)美好的未來
。


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