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BUNSEN本生：ELISA實驗操作的顯色和比色
更新時間：2023-07-18瀏覽：1024次

　　BUNSEN本生：ELISA實驗操作的顯色和比色


　　(一) 顯色

　　顯色是ELISA中的后一步溫育反應

，此時酶催化無色的底物生成有色的產(chǎn)物
。反應的溫度和時間仍是影響顯色的因素
。在一定時間內(nèi)
，陰性孔可保持無色
，而陽性孔則隨時間的延長而呈色加強。

　　適當提高溫度有助于加速顯色進行

。在定量測定中
，加入底物后的反應溫度和時間應按規(guī)定力求準確。定性測定的顯色可在室溫進行
，時間一般不需要嚴格控制
，有時可根據(jù)陽性對照孔和陰性對照孔的顯se情況適當縮短或延長反應時間，及時判斷
。

　　OPD底物顯色一般在室外溫或37℃反應20-30分鐘后即不再加深

，再延長反應時間，可使本底值增高
。OPD底物液受光照會自行變色
，顯色反應應避光進行，顯色反應結束時加入終止液終止反應
。OPD產(chǎn)物用硫酸終止后
，顯色由橙黃色轉(zhuǎn)向棕黃色。


404.png


　　TMB受光照的影響不大

，可在室溫中置于操作臺上
，邊反應觀察結果。但為保證實驗結果的穩(wěn)定性
，宜在規(guī)定的適當時間閱讀結果
。TMB經(jīng)HRP作用后，約40分鐘顯色達
，隨即逐漸減弱
，至2小時后即可*消退至無色。

　　TMB的終止液有多種

，疊氮鈉和十二烷基硫酸鈉(SDS)等酶抑制劑均可使反應終止
。這類終止劑尚能使藍色維持較長時間(12-24小時)不褪，是目視判斷的良好終止劑
。此外
，各類酸性終止液則會使藍色轉(zhuǎn)變成黃色，此時可用特定的波長(450nm)測讀吸光值
。

　　(二)比色

　　比色前應先用潔凈的吸水紙拭干板底附著的液體

，然后將板正確放入酶標比色儀的比色架中
。以軟板為載體的試驗，需先將板置于標準96孔的座架中
，才可進行比色
。

　　在加底物液顯色前，先將軟板邊緣剪凈

，這樣
，此板就可*平妥坐入座架中。 比色時應先以蒸餾水校零點
，測讀底物孔(未經(jīng)任何反應僅加底物液的孔)和空白孔(以生理鹽水或稀釋液代替標本作全過程的孔)
，以記錄本次試驗的試劑狀況。

　　其后可用空白孔以蒸餾水校零點

，以上各孔的吸光度需減去空白孔的吸光度
，然后進行計算。

　　比色結果的表達以往通用光密度(oplical density

，OD)
，現(xiàn)按規(guī)定用吸光度(absorbence，A)
，兩者含義相同
。通常的表示方法是，將吸收波長寫于A字母的右下角
，如OPD的吸收波長為492nm
，表示方法為"A492nm"或"OD492nm"。

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