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知識(shí)講解：細(xì)胞培養(yǎng)的步驟和注意事項(xiàng)
1:細(xì)胞復(fù)蘇
低溫保存的細(xì)胞從液氮中取出后，在37℃的水浴中不斷搖晃
加入DMEM清洗
2:細(xì)胞通道
當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%(早產(chǎn)不足
，細(xì)胞條件不好，1:2～1:10或以上比例傳代，一般1:3～1:5細(xì)胞發(fā)生，即從細(xì)胞接種到分離再培養(yǎng)的一段時(shí)間內(nèi)，非細(xì)胞有絲分裂的次數(shù))，取出完整培養(yǎng)基，洗滌兩次1x PBS。加入胰蛋白酶(注：消化液覆蓋細(xì)胞的最佳量，最佳消化溫度為37℃
。顯微鏡下觀察細(xì)胞：倒置顯微鏡下觀察消化細(xì)胞。如果細(xì)胞質(zhì)收縮，細(xì)胞不再連接成碎片，說明此時(shí)細(xì)胞的消化是合適的)，并將其放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中約2-3分鐘。加入適量DMEM全培養(yǎng)基停止胰蛋白酶消化
，移入離心管離心2分鐘，棄去上清液，然后加入DMEM全培養(yǎng)基洗滌，棄去上清液。加入DMEM全培養(yǎng)基，輕輕吹勻
，取10μL計(jì)數(shù)，按要求的細(xì)胞體積在含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。3:細(xì)胞冷凍保存
當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時(shí)
，去除全培養(yǎng)基，用1x PBS洗滌兩次。加入胰蛋白酶消化，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱約2-3分鐘。加入DMEM全培養(yǎng)基停止胰蛋白酶消化，移入離心管第二天放入液氮中
，至少可以保存兩年。如果沒有，可以保存三個(gè)月。細(xì)胞冷凍復(fù)蘇的原理是：緩慢冷凍和快速解凍
，這樣更有利于保持細(xì)胞的活力。不加任何保護(hù)劑的細(xì)胞低溫保存會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生冰晶，引起細(xì)胞內(nèi)的機(jī)械損傷、滲透壓、pH值和電解質(zhì)的變化，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。4:注意事項(xiàng)
(1) 預(yù)熱培養(yǎng)液：將配制好的含培養(yǎng)液
、PBS和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴中預(yù)熱;(2) 用75%酒精擦拭超凈工作臺(tái)和紫外線照射的手;
(3) 正確放置使用過的設(shè)備：保證足夠的操作空間
，既方便操作又減少污染;(4) 酒精燈：注意火焰不要太小;
(5) 嚴(yán)格無菌操作;
(6) 貼壁細(xì)胞的消化是中等的：消化時(shí)間受多種因素的影響，如消化液的種類
、制備時(shí)間和加入培養(yǎng)瓶中的量。在消化過程中，應(yīng)注意培養(yǎng)細(xì)胞形態(tài)的變化。一旦細(xì)胞質(zhì)收縮，連接變松，或有碎片漂浮的跡象，消化應(yīng)立即終止;(7) 傳代細(xì)胞的所有操作應(yīng)盡可能靠近酒精燈火焰
。最好一次只操作一個(gè)電池，每個(gè)電池使用一套設(shè)備(8) 每次打開或關(guān)閉細(xì)胞瓶口時(shí)
細(xì)胞培養(yǎng) 本生一直視質(zhì)量控制為企業(yè)的生命，追求企業(yè)競爭力的不斷提升
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