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酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定實(shí)驗(yàn)(ELISA)的操作流程
Elisa 操作流程(以人IL-4 ELISA KIT為例)：
檢測(cè)原理:
本實(shí)驗(yàn)采用雙抗體夾心ELISA法
?div id="4qifd00" class="flower right">試劑盒組成：
1.抗體預(yù)包被酶標(biāo)板(8×12 或 8×6)
2.凍干標(biāo)準(zhǔn)品(2 / 1 支;0.5ng/支)
3.標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本稀釋液(橙蓋瓶)(1 瓶;20ml/12ml)
4.濃縮生物素化抗體(紫蓋瓶)(1 支)
5.生物素化抗體稀釋液(藍(lán)蓋瓶)(1 瓶;16ml/10ml)
6.濃縮酶結(jié)合物(棕蓋瓶)(1 支)
7.酶結(jié)合物稀釋液(紫蓋瓶)(1 瓶;16ml/10ml)
8.濃縮洗滌液 20× (白蓋瓶)(1 瓶;50ml/25ml)
9.顯色底物(TMB)(棕蓋瓶)(1 瓶;12ml/6ml)
10.反應(yīng)終止液(紅蓋瓶)(1 瓶;12ml/6ml)
11.封板膠紙(6/3 張)
12.產(chǎn)品說明書(1 份)
酶聯(lián)免疫試劑盒標(biāo)本收集:
1. 收集血液的試管應(yīng)為一次性的無熱原，無內(nèi)毒素試管
。2. 血漿抗凝劑推薦使用EDTA
。避免使用溶血，高血脂標(biāo)本。3. 標(biāo)本應(yīng)清澈透明
，懸浮物應(yīng)離心去除。4. 標(biāo)本收集后若不及時(shí)檢測(cè)
，請(qǐng)按一次使用量分裝，凍存于-20℃，-70℃電冰箱內(nèi)，避免反復(fù)凍融，3-6月內(nèi)檢測(cè)。5. 如果您的樣本中檢測(cè)物濃度高于標(biāo)準(zhǔn)品最高值
，請(qǐng)根據(jù)實(shí)際情況，做適當(dāng)倍數(shù)稀釋(建 議做預(yù)實(shí)驗(yàn)，以確定稀釋倍數(shù))。酶聯(lián)免疫試劑盒 注意事項(xiàng):
1. 試劑盒使用前請(qǐng)保存在2-8℃
。復(fù)溶后的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)分裝后，將其放在-20～-70℃貯存。2. 濃縮生物素化抗體
，濃縮酶結(jié)合物體積小，運(yùn)輸中顛簸和可能的倒置3. 從冰箱中取出的濃縮洗滌液可能有結(jié)晶,屬于正常現(xiàn)象
4. 若需要分次使用標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)按照每一次用量分裝
5. 不同批號(hào)的試劑盒組份不能混用(洗滌液和反應(yīng)終止液除外)
6. 充分輕微混勻?qū)Ψ磻?yīng)結(jié)果尤為重要
7. 在試驗(yàn)中標(biāo)準(zhǔn)品和樣本檢測(cè)時(shí)建議作雙孔檢測(cè)。
8. 試驗(yàn)中所用的試管和吸頭均為一次性使用
，嚴(yán)禁在不同的液體之間混用!否則將影響試 驗(yàn)結(jié)果。9. 試驗(yàn)中請(qǐng)穿著試驗(yàn)服并帶乳膠手套做好防護(hù)工作。特別是檢測(cè)血液或者其他體液標(biāo)本時(shí)
， 請(qǐng)按國(guó)家生物試驗(yàn)室安全防護(hù)條列執(zhí)行。檢測(cè)前準(zhǔn)備工作:
1. 請(qǐng)?zhí)崆?0分鐘從冰箱中取出試劑盒，以平衡至室溫
。2. 將濃縮洗滌液用雙蒸水稀釋(1:20)
。未用完的放回4℃。3. 標(biāo)準(zhǔn)品: 加入標(biāo)準(zhǔn)品/標(biāo)本稀釋液0.5ml至凍干標(biāo)準(zhǔn)品中
，靜置15分鐘，待其充分溶解后，輕輕混勻(濃度為1000 pg/ml)。然后根據(jù)需要進(jìn)行稀釋。(建議標(biāo)準(zhǔn)曲線使用以下濃度： 1000、500、250、125、62.54. 生物素化抗體工作液：按當(dāng)次試驗(yàn)所需要得用量
5. 酶結(jié)合物工作液：按當(dāng)次試驗(yàn)所需要得用量
酶聯(lián)免疫試劑盒洗滌方法:
1. 自動(dòng)洗板機(jī)：要求注入的洗滌液為350ul
2. 手工洗板：甩盡孔內(nèi)液體
操作步驟:
1.從已平衡至室溫的密封袋中取出試驗(yàn)所需板條
2.空白孔加標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本稀釋液，其余相應(yīng)孔中加標(biāo)本或不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品(100ul/孔)
3.提前20分鐘準(zhǔn)備生物素化抗體工作液
4.洗板5次
5.空白孔加生物素化抗體稀釋液，其余孔加入生物素化抗體工作液(100ul/孔)
6.提前20分鐘準(zhǔn)備酶結(jié)合物工作液
7.洗板5次。
8.空白孔加酶結(jié)合物稀釋液
9.打開酶標(biāo)儀電源
10.洗板5次
11.加入顯色底物(TMB)100ul/孔，避光36℃孵箱
12.加入終止液100ul/孔, 混勻后即刻測(cè)量OD450值(3分鐘內(nèi))。在儀器保存讀數(shù)結(jié)果并打印一份紙質(zhì)結(jié)果
13.實(shí)驗(yàn)完畢后將未用完的試劑按規(guī)定的保存溫度放回電冰箱保存至有效期結(jié)束
建議保存酶標(biāo)板框，以備下次或者今后試驗(yàn)使用
結(jié)果判斷:
1. 每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本的OD值應(yīng)減去空白孔的OD值
2. 手工繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo)
3. 若標(biāo)本OD值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限
靈敏度
● 靈敏度：最小可測(cè)人IL-4達(dá)7pg/ml。
● 特異性：不與IL-1,2,3,5,6,8,10,12,IFN,TNF及sTNF-RII等反應(yīng)
● 重復(fù)性：板內(nèi)
Elisa試劑盒 本生一直視質(zhì)量控制為企業(yè)的生命
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