Elisa實(shí)驗(yàn)| 雙抗體夾心法ELISA實(shí)驗(yàn)操作
一
、標(biāo)準(zhǔn)品稀釋及樣品準(zhǔn)備
樣本離心4℃
，1000Xg，5min
標(biāo)準(zhǔn)品離心4℃
，10000Xg
，1min
1mL稀釋液溶解標(biāo)準(zhǔn)品
，靜置1-2min，取7支空EP管
，每管加入500μL標(biāo)準(zhǔn)品&樣品稀釋液
，靜置后標(biāo)準(zhǔn)品混勻，將液體離心至底部(800Xg，1min)
取同體積標(biāo)準(zhǔn)品原液稀釋
，渦旋混勻
，依次倍比稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，最后一管為空白
二
、酶標(biāo)板拆分
可按照實(shí)驗(yàn)需求拆裝板條
，讓板條松動并輕推底部，拆下板條防止在備用板框上
，剩余板條防至鋁箔袋
，封口存放。
三
、標(biāo)準(zhǔn)品及樣本點(diǎn)樣
由低到高濃度
，每孔100μL，懸空加入(建議均設(shè)置復(fù)孔)
處理后樣品取上清溶液
，懸空
，每孔100μL，腹膜后標(biāo)記
。提前預(yù)熱
，注意溫度，37℃孵育90min
。
四
、生物s化抗體工作液制備
取適量生物素化抗體稀釋液，加入濃縮液
，稀釋100倍后
，顛倒混勻20次，待用
。
取出酶標(biāo)板
，勿觸摸板條底部，甩盡孔內(nèi)液體后
，拍干
。將工作液倒入加樣槽，懸空垂直加入
，100μL/孔
，腹膜后標(biāo)記，37℃孵育60min
。
五
、1x洗液配制
根據(jù)需求取雙蒸水適量，取25x濃縮洗滌液適量
，加入燒杯
，磁力攪拌器混勻5-10min
。
六、濃縮HRP酶結(jié)合物工作液制備
取適量HRP酶結(jié)合物稀釋液
，加入濃縮液
，稀釋100倍后，顛倒混勻20次
，備用
取出酶標(biāo)板
，勿觸摸板條底部。輕撕覆膜
，避免液體濺出
。參數(shù)設(shè)定：洗滌次數(shù)3次、洗板條數(shù)12條
、洗滌液量350μL/孔
、震板5s。拍干液體
，更換吸水紙
。將工作液倒入加樣槽，懸空垂直加入
，100μL/孔
，腹膜后標(biāo)記，37℃孵育30min
。
七
、顯色
平衡取出酶標(biāo)板勿觸摸板條底部，輕撕覆膜
，避免液體濺出
，參數(shù)設(shè)定。洗滌次數(shù)5從
，洗板條數(shù)12條
，洗滌液量350μL/孔，震板5s
。拍干液體
，更換吸水紙。
將底物溶液倒入加樣槽
，懸空垂直加入
，90μL/孔
，腹膜后標(biāo)記
，37℃孵育15-30min。
八
、終止反應(yīng)
平衡取出酶標(biāo)板
，切勿觸摸板條底部，顯色后前四孔出現(xiàn)明顯藍(lán)色剃度。輕撕覆膜
，避免液體濺出
。懸空垂直加入，50μL/孔
，加入終止液時可看到藍(lán)色立轉(zhuǎn)為黃色
。
九、數(shù)據(jù)處理
輕輕擦拭板底
，放入酶標(biāo)儀中
，上機(jī)操作。
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