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ELISA試驗中吸光值(OD值)普遍偏高可能由多種因素引起，以下是本生技術(shù)小編對常見原因及對應的解決方案：
一
、常見原因及解決辦法1. 抗體或抗原濃度過高
原因：捕獲抗體
解決：
優(yōu)化抗體/抗原濃度
重新評估標準曲線的濃度范圍
。2. 酶標抗體過量或孵育時間過長
原因：酶標抗體濃度過高或孵育時間過長，導致底物過度催化
。解決：
稀釋酶標抗體或縮短孵育時間(建議參考說明書并優(yōu)化條件)
。嚴格按標準操作流程控制反應時間。
3. 底物反應時間過長
原因：底物(如TMB)顯色時間超出推薦范圍
，導致顏色過深解決：
嚴格控制顯色時間(通常TMB為10-15分鐘)。
顯色后立即終止反應(加入終止液)
4. 洗滌不充分
原因：未結(jié)合的抗體或酶標物殘留，增加背景信號
解決：
增加洗滌次數(shù)(通常3-5次)
確保每孔洗滌液充分填滿和排空，可使用自動洗板機優(yōu)化程序
5. 樣本或試劑污染
原因：樣本中存在干擾物質(zhì)(如溶血
解決：
離心去除顆粒物
更換新試劑
6. 板孔干燥或密封不當
原因：孵育過程中板孔干燥，導致非特異性結(jié)合增加
解決：
孵育時使用封板膜密封板孔
控制孵育濕度(如放置在濕盒中)
7. 儀器或讀數(shù)錯誤
原因：酶標儀波長設(shè)置錯誤(如TMB應為450nm
解決：
核對酶標儀波長是否正確，定期校準儀器
。確保板底清潔無劃痕
，避免光學干擾。8. 非特異性結(jié)合(高背景)
原因：封閉不充分或封閉蛋白與抗體交叉反應
。解決：
更換封閉劑(如使用BSA、脫脂奶粉或商業(yè)化封閉液)
。延長封閉時間(通常1-2小時)或提高封閉劑濃度(如5% BSA)
。9. 標準品或試劑失效
原因：標準品降解、底物溶液變質(zhì)(如TMB暴露于光線下)
。解決：
檢查試劑有效期
，避光保存底物。重新配制標準品或更換新試劑
二
空白對照檢查：確認空白孔(僅底物+終止液)OD值是否正常(通常<0.1)。
梯度稀釋驗證：對樣本或標準品進行稀釋
重復實驗：更換新試劑/板條重復實驗，排除偶然誤差
對照孔分析：檢查陰性對照是否正常
三
嚴格遵循試劑說明書操作
定期校準儀器
記錄每次實驗細節(jié)(孵育時間、洗滌次數(shù)等)
通過以上方法逐步排查，可有效解決OD值偏高的問題
注：以上資料僅供參考
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