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DNA提取方法的總結
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更新時間：2019-10-25瀏覽：2933次

DNA提取方法的一些總結：

細菌DNA的提?div id="d48novz" class="flower left">

。?/span>
（一）
試劑：
1. 抽提緩沖液
2% CTAB (W/V)
2% PVP K25 (w/v) （去色素）
100mM Tris-HCl (pH8.0)
25mM EDTA (pH8.0)
2.0M NaCl
2.10M LiCl
3. 2M LiCl
4.DEPC-water（抑制RNA酶活性）
5. 3M NaAc (pH5.2)
6. 96% 乙醇
7. 70% 乙醇
步驟：
1.抽提緩沖液65℃預熱
；
2. 加菌體到已經預熱的緩沖液（700ul）中混勻
，65℃
，10min
；
3. 加酚/LV仿/異戊醇（25：24：1）
，振蕩
，離心12,000rpm
，10min；
4.取上清
，加LV/異戊醇（24：1）振蕩
，離心12,000rpm，10min
；
5. 取上清
，重復4步驟
；
6. 加入1/10體積的3M醋酸鈉和1.5倍體積的乙醇（或加入等體積的異丙醇），－20C沉淀
；
11. 離心12,000rpm
，10min；
12. 棄上清
，70％乙醇洗
，也可以再用100％乙醇洗，然后溶解于100ml 水中
。
(二)（我們常用的方法
，但是有時有些細菌特別不好提，就用上面的方法）
1. 將菌株接種于液體LB培養(yǎng)基
，37℃震蕩培養(yǎng)過夜
。
2. 取1.5ml培養(yǎng)物12000rpm離心2min。
3. 沉淀物加入567 ul的TE緩沖液
，反復吹打使之重新懸浮
，加入30ul 10%SDS和15ul的蛋白酶K，混勻
，于37℃溫育1h.
4. 加入100ul 5mol/L NaCl, 充分混勻
，再加入80ul CTAB/NaCl溶液，混勻后再65℃溫育10min
。
5. 加入等體積的酚/LV/異戊醇混勻
，離心4-5min, 將上清轉入一只新管中，加入0.6-0.8倍體積的異丙醇
，輕輕混合直到DNA沉淀下來
，沉淀可稍加離心。
6. 沉淀用1ml的70%乙醇洗滌后
，離心棄乙醇．
真菌DNA的提?div id="d48novz" class="flower left">
。?/span>
（一）
1.取真菌菌絲0.5g, 在液氮中迅速研磨成粉
2.加入4mL提取液，快速振蕩混勻
3.加入等體積的4mL的LV:異戊醇(24:1)
，渦旋3～5min（此處是粗提沒有加酚
，可以節(jié)約成本的喲！）
4.1000rpm
，4℃
，5min
5.上清用體積的LV:異戊醇(24:1)再抽提一次（10,000 rpm，4℃離心5 min）
6.取上清
，加入2/3倍體積的-20℃預冷異丙醇或2.5倍體積的無水乙醇沉淀, 混勻, 靜置約30 min
7.用毛細玻棒挑出絮狀沉淀, 用75%乙醇反復漂洗數(shù)次, 再用無水乙醇漂洗1次, 吹干
，重懸于500 ?ulTE中
8.加入1 ul RNaseA （10 mg/mL），37℃處理1 hr
9.用酚（pH8.0）:LV仿:異戊醇(25:24:1)和LV仿:異戊醇(24:1)各抽提1次（10,000 rpm
，4℃離心5 min）
10.取上清
，1/10V 3M NaAc,2.5V體積的無水乙醇, -70℃沉淀30 min以上
11.沉淀用75%乙醇漂洗
，風干, 溶于200 ulTE中，-20 ℃保存?zhèn)溆?/span>
DNA提取液：0.2M Tris-HCl（pH 7.5）
，0.5M NaCl
，0.01M EDTA，1％SDS
，
3M NaAc
（二）
1.真菌菌絲0.5-1 g, 在液氮中迅速研磨成粉
2.加入3 mL 65℃預熱的DNA提取緩沖液
，快速振蕩混勻65℃水浴30 min, 期間混勻2-3次
3．加入1 mL 5M KAc，冰浴20 min
4．等體積的LV仿:異戊醇(24:1)抽提1次（10,000 rpm
，4℃離心5 min）
5．取上清
，加入2/3倍體積的-20℃預冷異丙醇, 混勻, 靜置約30 min
6．用毛細玻棒挑出絮狀沉淀, 用75%乙醇反復漂洗數(shù)次, 再用無水乙醇漂洗1次, 吹干，重懸于500 ?L TE中
7．加入1 ul RNaseA （10 mg/mL）
，37℃處理1 hr
8．用酚（pH8.0）:LV仿:異戊醇(25:24:1)和LV仿:異戊醇(24:1)各抽提1次（10,000 rpm
，4℃離心5 min）
9．取上清，1/10V 3M NaAc,2.5V體積的無水乙醇, -70℃沉淀30 min以上
10．沉淀用75%乙醇漂洗
，風干, 溶于200 ul TE中
，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/span>

 

注：僅供參考！

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